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                  細胞破碎設備和技術綜述

                  更新時間:2024-03-21      點擊次數:148

                  珠磨均質機

                  超過40%的實驗室勻漿器專門用于破碎細胞。在實驗室均質器的一般類別中,珠磨,通常稱為串珠,是這一大類中的最新產品,是傳統的轉子-定子和超聲波方法成為細胞和組織破碎的方法。

                  在珠磨過程中,將組織或微生物的懸浮液與大量微小的玻璃、陶瓷或鋼珠混合,并通過搖動或攪拌進行劇烈攪拌。當珠子與細胞碰撞時,通過珠子的壓碎作用發生細胞破裂。與超聲波和高壓細胞破碎方法相比,珠磨法的剪切力相對較低。通過選擇正確大小的珠子和適度的搖動速度,細胞膜的回收率很高,并且通??梢苑蛛x出完整的細胞內細胞器。在較高的振蕩能量下,beadbeating被認為是破碎孢子、酵母和真菌的方法,并成功地應用于難以破碎的細胞,如藍細菌、分枝桿菌、孢子和微藻。最近,珠磨機均化已應用于土壤樣品和植物及動物組織的小樣品。如果采用PCR技術,這種均質化方法是少數幾種可以避免樣品之間交叉污染的方法之一-主要是因為該方法中使用的小瓶和珠子都是一次性物品。

                  所用珠子的直徑很重要。細菌和孢子的最佳尺寸為0.1毫米,酵母、菌絲體、微藻和單細胞動物細胞如白細胞或胰蛋白酶組織培養細胞的最佳尺寸為0.5毫米,組織如腦、肌肉、葉子和皮膚的最佳尺寸為1.0或2.5毫米。通過使用由氧化鋯-二氧化硅或氧化鋯而不是玻璃制成的類似尺寸但更重的陶瓷珠,破碎速度提高了約50%。破壞真正堅韌的組織有時需要鉻鋼珠——其密度是玻璃珠的5倍。

                  雖然微型閥中的鋼珠可用于“搖動式珠磨機",但它們太重而無法用于“轉子式珠磨機"。即便如此,在一些高能振動式珠磨機中,鋼珠可能會使常見的聚丙烯微孔破裂。為了避免這種微孔限制,俄克拉荷馬州巴特爾斯維爾的BioSpec Products公司提供了強化聚丙烯微孔(品牌為“XXTuff")或不銹鋼微孔。有報道稱,由碳化硅或石榴石制成的邊緣鋒利的非珠狀顆粒也能很好地破壞堅韌的組織。小瓶中足夠的珠裝量通常約為小瓶總體積的20-50%。并且,在轉子型壓條攪拌器的情況下,相對于腔室容積的壓條裝載容積約為50%。通常,珠子與細胞懸浮液的體積比越高,細胞破碎的速度越快。在珠磨機中均化后,珠子通過重力快速沉降,并通過移液移除勻漿。

                  可以使用珠磨技術手動破碎微生物和組織:雖然這種手持方法繁瑣而緩慢,但它可以作為珠磨法的初步測試:將懸浮在1mL提取介質中的微生物細胞或組織(預先切碎成非常小的碎片)添加到預先裝有1mL適當大小珠子的2 mL微孔中。蓋上微孔蓋,在實驗室渦旋混合器上攪拌混合物十分鐘。


                  搖動式珠磨機

                  標準搖動式珠磨機(又名Beadbeater)可使用2 mL聚丙烯螺旋蓋微量量具處理高達500 mg(濕重)的樣品。還提供可容納7 mL或更大試管的珠磨機附件。必須始終使用螺旋蓋,因為在高能搖動過程中,彈簧蓋微孔會釋放出內含物的氣溶膠。這些珠磨機將小瓶保持在垂直位置或更有效的接近水平的位置。幾乎所有的機器都沿著小瓶的軸線方向搖動珠子,小瓶前后搖動的模式可以是線性的,也可以是壓縮的8字形。雖然不同品牌的珠磨機之間存在一些明顯的性能差異,尤其是在破碎堅韌的細胞或組織時,全破碎通常需要大約1-3分鐘,并且細胞內生化物質的產量非常高。打珠后,珠子在重力作用下在幾秒鐘內沉淀下來,細胞提取物很容易用移液管移出。

                  1979年,BioSpec Products推出實驗室規模的珠磨細胞粉碎機,并在市場上占據了大約20年的時間。該公司現在生產六種型號的高能實驗室級珠磨機。mini beater-Plus可容納一個2 mL螺旋蓋微量比色皿,而其他三個mini beater型號一次可處理多達16、24或48個2mL微量比色皿。mini beater-96還可以處理96個深孔微孔板中的樣品。他們還提供了一個可處理高達80克(濕重)微生物細胞的制備型實驗室攪拌機。他們的最新產品SoniBeast可處理12個0.6毫升微管或3個2毫升微量管,與搖動式珠子攪拌器不同的是,它使用超高渦流運動攪拌珠子,該運動由30,000 rpm(500Hz)的電機驅動。SoniBeast在幾秒鐘內而不是幾分鐘內破碎細胞,使其成為市場上最快的珠磨細胞破碎機。

                  轉子-定子均質機(也稱為膠體磨或Willems均質機)

                  這些均質器非常適合在1毫升到幾升的液體介質中均質植物和動物組織。它們通常優于刀片式折彎機。與攪拌機相比,起泡和充氣現象最少,并且易于容納小得多的樣品體積。細胞物質通過位于長靜態管或探針(通常稱為定子)末端內部的轉子產生的吸力被吸入設備。然后,材料通過位于定子附近的槽或孔離心排出。組織被反復回收,并且由于轉子以非常高的速度轉動,在液體剪切力和發生在探針的機械剪刀狀剪切的共同作用下,組織的尺寸減小。根據組織樣本的韌性,通常在5-60秒內獲得所需的結果。對于細胞內細胞器或受體位點復合物的回收,使用較短的時間和/或降低的轉子速度。當使用較小尺寸的轉子-定子探頭時,在處理前必須用手術刀或剃刀片將組織樣本預先切成橫截面小于1 mm的碎片,以便將樣本吸入定子的孔內。如果樣本已經冷凍保存,可以使用低溫粉碎器(一種在液氮溫度下快速粉碎組織的設備-見下文)在不解凍的情況下將組織樣本破碎成小塊。一些轉子-定子制造商提供的探頭在定子頂端有一圈鋸齒狀的齒,這有助于破碎最初太大而無法進入探頭的樣品。該功能很有幫助,但同質化時間可能會更長。與許多其他類型的機械細胞破裂機不同,轉子-定子均質機在運行過程中基本不產生熱量此外,轉子-定子均質機不能溶解微生物-這一特性在研究土壤、糞便等中的微生物時很有用。

                  大多數實驗室轉子-定子均質機都是頂部驅動的,帶有一個轉速為8,000至35,000 rpm的緊湊型高速電機。轉子-定子探針(統稱為發生器)的尺寸可以從用于0.5-50毫升樣品體積的吸管直徑到能夠處理10升或更多批次的更大裝置不等。轉子速度和定子直徑之間存在重要關系。原則上,轉子直徑每減半,均質機的最高轉子速度應加倍。它不是rpm就其本身而言,但是轉子的速度是重要的操作參數。每秒10至20米(2000至4000英尺/分鐘)是組織破碎可接受的速度。不幸的是,大多數小到足以輕松裝入微管的商用轉子-定子均質機都達不到這一速度標準。在選擇轉子-定子均質機時,其他因素如轉子-定子設計(有很多)、結構中使用的材料以及清潔的難易程度也是需要考慮的重要因素。

                  實驗室尺寸的均質器僅適用于中低粘度范圍的液體樣品。由于使用太小的裝置,均化的速度和效率受到影響,并且給定均化器的轉子-定子探針尺寸有效工作的體積范圍只有大約十倍。轉子-定子均質機可能會出現泡沫和氣溶膠問題。保持均質機的一端浸沒在培養基中,并使用大小合適的容器有助于解決第一個問題。方形均化容器比圓形容器效果更好,并且有利于將浸沒的探針保持在偏心位置。通過使用適當覆蓋的容器(VirTis、Brinkmann和Omni),可以最大限度地減少氣溶膠,但不能消除氣溶膠。盡管許多實驗室轉子-定子均質機使用全封閉電機,但沒有一臺電機是防爆的。因此,使用易燃有機溶劑(如丙酮、酒精或氯仿)時,應小心謹慎,在通風良好的通風柜中進行均化。

                  底部驅動實驗室轉子-定子均質機是實驗室的新成員。轉子-定子組件通常放置在密封的腔室或容器內,適合攪拌機電機底座,工作容積為100-1000毫升。

                  分散器  

                  與轉子-定子均質器密切相關,分散器用于制備大量植物和動物水提物。轉子-定子機構的構造類似于家庭垃圾處理裝置,可快速均勻化和液化千克數量的生物質。樣品懸浮在一升或多升介質中,裝入頂部容器中,以連續或分批模式均質化。

                  葉片式均質機

                  盡管效率不如轉子-定子均質機,并且通氣和起泡可能是一個問題,但葉片均質機(通常稱為攪拌機)多年來一直用于從植物和動物組織中生產優質布里干酪和提取物。攪拌機不能有效地破壞微生物。在這類均質機中,一組不銹鋼刀片在玻璃、塑料或不銹鋼容器內以6000-50000 rpm的速度旋轉。葉片可以是底部驅動的,也可以是頂部驅動的。如流式細胞儀分析所確定的,一些高速勻漿器可以將組織樣品減小到一致的顆粒大小,其分布小至4微米?;旌虾?,一些植物組織勻漿會發生酶促褐變-這是一種氧化和化學交聯過程,會使隨后的分離過程變得復雜。通過在無氧或除氧硫醇化合物如巰基乙醇存在下進行提取,酶促褐變被最小化。聚乙烯亞胺、金屬螯合劑或某些溫和洗滌劑(如Triton X-100或Tween 80)的添加也將酶促褐變降低。

                  使用攪拌機時,與酒精或丙酮等易燃溶劑混合時要小心。攪拌機使用有刷電機來實現高速運轉,因此在運轉過程中會產生火花。此外,混合時容易形成氣溶膠。勻漿病變組織時,使用密封的攪拌器容器,并在通風良好的安全罩中操作。

                  冷凍斷裂或冷凍硬化

                  微生物糊和動植物組織可以在液氮中冷凍,然后在同樣的低溫下用研缽和杵研磨。堅硬的冷凍細胞因其易碎性而破裂。此外,在如此低的溫度下,內部冰晶可能會產生磨損。這一過程的最終產物可以是鹽粒大小的極小組織塊,也可以是幾乎所有細胞都被破壞的制劑。關于后者,低溫冷凍是一種機械細胞破碎方法,能夠遞送非常高分子量的DNA。

                  杵和管勻漿器(也稱為組織研磨機)

                  用來破壞新鮮的動物組織。盡管研杵和試管均質器的變體有諸如波特、波特-埃爾維耶姆、唐斯和Ten Broeck之類的名稱,但作為一個整體,它們由玻璃、惰性塑料或不銹鋼制成的試管組成,其中插入了由類似材料制成的緊密配合的研杵,間隙約為0.1-0.2毫米。試管和研杵的壁可以是光滑的或經過研磨的。大多數組織必須用剪刀或單刃刀片切割或剁碎成小塊(橫截面約1毫米),然后懸浮在試管中3-10倍體積的培養基中。杵被手動操作到管的底部,從而當組織被迫在杵的緊密配合側和管壁之間流動時撕裂和壓碎組織。當杵縮回時,研磨動作再次發生。這種低剪切方法需要重復五到三十次才能使大多數組織均質化。當試管被手動升高和降低時,通過連接到電動機的研杵以大約500-1000 rpm的速度旋轉來加速該過程。雖然杵和管均質很簡單,使用的設備通常也不貴,但該過程是勞動密集型的,并且當使用易碎的玻璃均質器時,存在潛在的危險。即便如此,這種均質機仍因其極其溫和的作用而繼續受到歡迎。這通常是從腦或肝等動物軟組織中制備少量亞細胞器的方法。微生物不能用杵式均質機破碎。

                  固體組織壓榨機和分散機

                  有幾種機械裝置通過迫使固體組織樣本穿過一系列小孔或不銹鋼篩網來將軟組織縮小到更小的尺寸。在大多數情況下,在均質化之前沒有向樣品中加入液體介質,并且根據所用的壓機,排出的分散組織可以具有從漢堡肉到糊狀肝醬的不同質地。雖然這不是破壞細胞的有效方法本身時,它被用作使用其他物理、化學或酶方法進行均質化的預備步驟。

                  家用絞肉機或絞肉機已經用于制備分散的動物組織幾十年了。組織被機械地推過金屬篩板上的小孔,同時旋轉的刀片慢慢掃過篩板的表面,并將擠出的肉切成0.3 - 0.5毫米的碎片。如果組織稍微冷凍處理,絞肉機可以更好地切割肌肉等柔性組織。

                  超聲波粉碎機

                  這些設備在液體介質中產生強烈的聲波壓力波,并廣泛用于破壞細胞。在適當的條件下,高壓波會在超聲波探頭表面附近形成短暫的微泡,這些微泡會劇烈生長和破裂。內爆產生的沖擊波被稱為空化,其能量足以撕裂細胞膜,甚至可以破壞共價鍵。

                  現代超聲波處理器使用由鋯鈦酸鉛晶體制成的壓電發生器。振動通過鈦金屬喇叭或探針傳遞,該喇叭或探針被調整為使處理器單元以15-25 kHz的頻率共振。超聲波處理器的額定功率輸出從10瓦到375瓦不等。真正重要的是探針的功率密度。正如預期的那樣,需要更高的輸出功率來維持大尺寸探頭的良好性能。對于細胞破碎,探針密度應至少為100 W/cm2,并且振動幅度越大越好(典型范圍:30-250微米)。


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